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基因工程途径改良水稻品质与营养价值 
作者:王金花 罗文永 李晓方
来源:见正文
发布时间:2004-9-16 8:17:06

    水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的粮食作物,是全球近一半人口赖以生存的基本食粮。人们通过各类基因载体将外源基因导入水稻,打破了基因重组和基因转移的物种界限,可以按人们的要求进行基因重组和基因改造。自1989年Shimamoto等获得第一批可育的转基因水稻植株以来,转基因技术在水稻种植创新方面发挥着越来越重要的作用。以往的多数研究注重对高产、抗病、抗虫、抗病毒、抗除草剂等方面的探讨,对品质改良和营养、药用价值提高的研究较少。但是随着人们的需求变化,这方面的研究也越来越受到重视。本文就近十年来的研究及其进展作一综述。

1 水稻品质改良

    水稻品质改良包括淀粉、蛋白质等方面改良,具体改进水稻中的淀粉、直链淀粉、赖氨酸、硫氨酸等的含量。

1.1 淀粉品质改良

    研究表明,直链淀粉含量过高是造成杂交水稻食用品质差的主要原因之一。不同水稻品种的直链淀粉含量的差异较大,一般籼稻品种的直链淀粉含量较粳稻高,在20%~30%居多,粳稻的在15%~22%。不同地区或不同年龄的人对稻米中直链淀粉含量的要求也有所不同,但都倾向于食用中等或偏低直链淀粉含量的稻米。

    水稻胚乳中直链淀粉的合成是由蜡质基因(waxy,Wx)编码的淀粉粒结合淀粉合成酶(granule bound starch synthase,GBSS)控制的,该基因同时可控制水稻花粉和胚囊中直链淀粉的合成,是一个组织发育和特异性表达的基因。通过对Wx基因的遗传操作来控制水稻种子中直链淀粉的合成,从而改变其相对含量,达到改良稻米淀粉品质和食用品质的目的。刘巧泉等和Terada等先后将反义蜡质基因导入不同的粳稻品种中,证明转基因水稻成熟种子中的直链淀粉含量有不同程度的下降。陈秀花、刘巧泉(Liu Qiaoquan)等通过农杆菌介导,将反义Wx基因导入我国籼型杂交稻的保持系龙特甫B等3个高直链淀粉含量的重点亲本中,结果表明,多数转基因水稻的直链淀粉含量出现不同程度的降低,最低下降至7%左右。

1.2 蛋白质改良

    水稻种子中的蛋白质含量约为5%~8%,在禾本科作物中为最少。水稻的储藏蛋白以谷蛋白为主。

1.2.1 改善蛋白质成分

    通过转谷蛋白A反义基因可以降低谷蛋白含量。Yoshiyuki等检测了两个转基因品系H39-59和H75-3的T2、T4代。在大田生长的两个品系,其T4代均表现出种子的谷蛋白含量降低了20%到40%,而醇溶谷蛋白含量提高。用普通水稻酿酒时,水稻蛋白质往往被分解为缩氨酸等氨基酸,而过多的氨基酸常常导致米酒的口味差并加速米酒变质。而用含有较高醇溶谷蛋白的转基因水稻酿制的酒,其口感好、保质期也延长。

1.2.2 改变水稻贮藏蛋白的氨基酸组成

    人类的饮食中八种必需氨基酸通常来源于植物。然而没有任何一种植物储存器官中含有所有这八种氨基酸,豆类蛋白中缺乏含硫氨酸——甲硫氨酸和半胱氨酸,而谷类蛋白中缺乏赖氨酸和色氨酸。在高等植物中赖氨酸是通过天冬氨酸途径合成的,并伴随异亮氨酸、甲硫氨酸和苏氨酸的合成。控制这条途径的关键酶是天冬氨酸激酶(AK)和二氢吡啶羧酸合酶(DHPS)。天冬氨酸和二氢吡啶是赖氨酸合成的反馈调节因子。在细菌中赖氨酸的合成途径与植物的非常相似,但是DHPS对赖氨酸的反馈抑制调节不敏感。利用此优点,导入连接有质体导肽的细菌dhps基因,可使转基因植物中的赖氨酸含量明显提高。

    Lee Soo In等将玉米赖氨酸反应不敏感基因 dhps全长cDNA分别连上CaMV 35S启动子(超表达)和水稻种子专一性谷蛋白GluB-1启动子(种子特异性表达)构建载体,进一步转化水稻。用CaMV35S做启动子的转基因品系(简称TC),其DHPS转录水平高于以GluB-1为启动子品系(简称TS)10~100倍。TC和TS未成熟种子的自由赖氨酸含量均高于野生型植株。种子成熟以后,TC的自由赖氨酸含量仍高于野生型,但TS则和野生型很接近。通过比较DHPS和赖氨酸酮戊二酸酯还原酶(lysine-ketoglutarate reductase,LKR)的表达水平,Lee Soo In等(2001年)认为外源dhps能够提高LKR的活性,从而导致赖氨酸的分解代谢增强。但是TC超量表达dhps能够抑制赖氨酸分解代谢,从而维持成熟种子的高赖氨酸水平。而TS可能因为在种子发育过程中,自由赖氨酸只是瞬时大量表达。瞬时表达引起了LKR活性增强,而其又没有足够的能力抑制LKR,所以成熟种子中赖氨酸的含量和野生型的相比没有明显变化。

    植物中遗传密码子的使用频率与动物的相同,对外源基因的一些密码子进行替换能够显著提高该基因在植物体内的表达水平。Wu等利用微弹法,将编码tRNAly8(赖氨酸摆动密码子)的DNAs转入水稻愈伤组织。DNAs能引起赖氨酸插入种子中谷氨酸和天冬氨酸特别丰富的氨基酸序列中,也能使赖氨酸和终止密码子连在一起,让蛋白质合成结束或高频率地中断种子的蛋白质合成。转基因再生植株的检测发现蛋白质的组成类型没有明显变化。在一部分植株中2%~3%的谷蛋白发生变化,同时发现醇溶蛋白中赖氨酸提高了40%~75%。这些转基因水稻的赖氨酸含量平均提高了6%,这个水平大大地超过了用其他方法获得的表达量。温室中培养的转基因植株并没有受到蛋白质异常合成的影响,生长和繁殖状况良好,但还需要在大田进行试验以确定其环境适应性和产量。

    虽然已经获得的转基因水稻的赖氨酸含量提高了,但是它的量还不足以充分地满足人们对其需求量。因此,进一步的工作可以在种子蛋白质合成过程中通过促进可变tRNAs的利用把不同类型的可变tRNAlys整合到同一植株中,或者通过提高赖氨酸的生物合成,从而提高赖氨酸的表达量。

2 水稻微量营养改良

    世界人口中超过40%的人在受到微量营养不良的折磨。科学家们认为,摆脱营养危机的办法是尽快培育出含丰富微量营养元素的新品种,尽量从天然食品中获取足够的微量营养。研究证实微量营养的增强特性就存在于作物的基因组中,可以在不影响作物产量的情况下提高Fe,Zn和维生素A原等的含量。

2.1 人体必需微量元素的相关蛋白基因导入水稻

    在植物中铁蛋白是铁的主要储藏蛋白。Goto等以GluBl启动子作为编码大豆铁蛋白基因的启动子使其在水稻胚乳中表达,检测发现转化植株种子中铁的含量提高了3倍。含铁稻米能够减少缺铁性贫血的发生率。Goto等推测转基因水稻每餐能够提供成人每日铁需求量的30%~50%。此外,大豆蛋白质还能降低人体中血液中的胆固醇,并具有水溶性。部分粮食作物由于肌醇六磷酸和其它的反义营养因子而导致铁吸收量低。转基因技术有望改善这部分粮食作物的铁吸收量,提高铁含量。

    Zn含量的提高受到运载蛋白的表达的影响。在酵母和拟南芥中分离到编码Zn转运蛋白ZIP1, ZIP2和ZIP3三个基因(Grotz等,1998年;Zhao and Eide,1996年)。Zn转运蛋白在根部Zn缺乏的条件下表达,并且和Zn的更新有着密切的关系。Zn转运基因可通过基因工程的办法增强谷物Zn的更新和积累能力,从而提高其营养价值,目前正在应用Zn转运基因对水稻进行改良。

    硒是人体必需的微量元素,成年人和儿童硒摄入不足可导致人体的免疫系统遭受损害。转基因富硒水稻正在研究之中。

2.2 转基因黄金水稻培育

    在世界最贫穷的人口中,维生素A缺乏症每年导致50万人永远失明和多达100万人死亡。转基因黄金水稻就是为了对付这一疾病而产生的。水稻未成熟胚乳能够合成β-胡萝卜素的早期中间产物栊牛儿二磷酸(GGPP),它能在八氢番茄红素合成酶(psy)的作用下形成无色的八氢番茄红素,在八氢番茄红素脱饱和酶(crtI)的作用下形成番茄红素,经番茄红素13.环化酶(lcy)的作用产生 β-胡萝卜素及其它类胡萝卜素。因此,要使水稻胚乳能够合成β-胡萝卜素,就需要将外源的psy基因、crtI和lcy基因以及相应的启动子和其它调控序列转化到水稻中去。

    利用源于细菌的crtI,以及源于黄水仙的psy和lcy,以不同的基因组合插入三种载体中,crtI受CaMV 35S启动子的控制,psy和lcy则受胚乳专一性的水稻谷蛋白启动子所控制,同时,这些载体中的功能性转运肽序列,能引导基因产物进入胚乳质体,确保最终产物在胚乳中形成。应用农杆菌进行转化,转基因粳稻台北309所结种子的胚乳中含β-胡萝卜素,呈现金黄色,因此被称为金米。初步分析表明,胚乳中的类胡萝卜素含量达1.6 μg/g,其中以β-胡萝卜素为主。

3 药用价值转基因水稻培育

3.1 药用抗菌水稻

    人类天然的溶菌酶在母乳中含量有50~400 μg/ml,它能够破坏细菌细胞壁的肽聚糖层,从而杀死细菌,减少儿童发生腹泻或上呼吸道感染几率。将人的溶菌酶基因连上水稻谷蛋白Gt-1启动子及信号肽在粳稻台北309中表达,溶菌酶的表达量在干种子达到O.6%,在可溶性蛋白质中达到45%,T1至T6转基因后代的检测发现溶菌酶可以稳定表达。含有溶菌酶的稻米粉可作为婴幼儿食品的组成成分,避免了蛋白质纯化过程,不但降低了成本,同时又提高了营养价值。

3.2 利用转基因水稻生产抗体

    在植物中表达编码抗体或抗体分子片段(如 Fab片段和单链可变区scFv)的基因,获得的产物称为植物抗体(plantibodies)。水稻能够生产完整的单链可变区片段(scFv),作为scFv抗体药物生产和储存载体。

    Stoger Eva等将针对癌胚抗原(carcino- embryonic antigen,CEA)的单链Fv抗体(ScFvT84.66)基因在水稻和小麦中表达。CEA是一种细胞表面糖蛋白,是肿瘤相关抗原的最明显特征之一。人们应用针对CEA的抗体进行体内肿瘤成像以及肿瘤治疗。scFv的载体构建使重组抗体定位在水稻的离质体(apoplast)和内质网表达。在水稻的种子与叶子检测到大约30μg/g的功能重组抗体。作为宿主,水稻种子还具有易储存的优点。另外,实验还表明,转基因种子在室温下储存五个月以内 scFvT84.66的含量和活性没有明显地下降。

3.3 口服疫苗

    转基因水稻生产口服疫苗的前景非常诱人。在水稻组织内合成某种致病原性蛋白,然后作为可口服的亚单位疫苗给人服用,人体就会产生相应的抗体,具有抵抗该致病原的能力。

    重组Cry j 1(日本雪松花粉过敏原之一)在水稻中进行表达,种子有可能用于口服免疫疗法。 Cry j 1 cDNA分为两部分:N-末端和C-末端各占一半,他们都融合有下游谷蛋白GluB-1基因,包含启动子序列、5"非转录区和信号肽。绿色荧光蛋白基因也被整合到Cry j 1片段的3"末端。在转基因水稻种子中,相当于16.6μg/mg的Cry j 1总蛋白表达。免疫原性和致敏性测定发现Cry j 1没有与IgE发生明显地反应,表明大大地减少了过敏反应的风险。

4 问题与展望

    通过基因工程技术获得在生产上可推广的以上这些转基因水稻,目前还面临着许多问题与挑战。其中包括:(1)外源基因表达水平的提高。目前的策略主要集中在控制基因沉默,筛选利用更强的启动子。(2)水稻蒸煮以后其中的疫苗或抗体活性可能降低,甚至失活。(3)目的基因在水稻中定位、定时表达问题。如转入外源基因后,有时水稻会出现生长不良。(4)食用的安全性问题。

    转基因水稻是高科技产品,培育出更多营养品质优良、微量营养丰富、药用价值高的水稻品种,适应人们的不同需求,对农业发展有重大带动作用,具有巨大的发展潜力和市场竞争力。

    注:
    (1)文章来源:中国生物工程杂志,2004年第24卷第8期。

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